Detection of BRAF V600E mutation in ctDNA by ddPCR: from laboratory to market

Cutaneous melanoma is the most aggressive form of skin cancer and has a high mortality rate. The current methods used to stage melanoma and detect metastases are imaging techniques and sentinel lymph node biopsies (SLNB). However, these have limited sensitivity for the detection of early stage melanoma and often can’t provide timely clinical evidence of disease recurrence or for monitoring therapies. Cell-free tumour DNA (ctDNA) could be a specific biomarker in melanoma patients which present V600E mutation in BRAF gene. ctDNA is released by cancer cells into the bloodstream and then excreted in urine, allowing it to be analysed by liquid biopsy. This analysis provides a real-time snapshot of tumour burden and represents a non-invasive, cost-effective alternative that can be performed repeatedly. In this work, a surveillance tool was implemented to help patients with melanoma through the detection of BRAF V600E mutation in ctDNA by Droplet Digital PCR (ddPCR). Firstly, we focused on design and optimization of the assay to ensure a low limit of detection and a distinction between false-positives and true-positives. Secondly, the assay was tested in order to show the possibility to detect V600E mutation in BRAF gene in plasma and midstream urine samples from melanoma patients. In addition to the test implementation, a go-to-market strategy was explored for the commercialization of the test through a collection kit. This test is directed to laboratories, clinics and hospitals aiming to help doctors in the diagnosis, prognosis and treatment of their patients. After a market analysis, we concluded that the new test has advantages over existing competitors in the market and has a potential to improve the melanoma management

Chemotherapy-induced cardiotoxicity in breast cancer

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2022A neoplasia da mama é o segundo cancro mais comum em mulheres com cerca de 2.3 milhões de novos casos em 2020. A melhoria da taxa de sobrevivência nas últimas duas décadas devido a progressos no tratamento acompanhou-se por aumento dos efeitos adversos, particularmente cardíacos, ameaçando comprometer a eficácia das terapias disponíveis. A cardiotoxicidade é um dos efeitos adversos mais associados aos agentes antineoplásicos das terapias da neoplasia mamária. A sua prevenção, monitorização, diagnóstico e tratamento são cruciais para melhorar o prognóstico. Esta tese procura efetuar uma revisão da literatura existente acerca da toxicidade cardiovascular associada à quimioterapia do cancro da mama, com enfoque nos efeitos adversos mais comuns. Os agentes citotóxicos mais frequentemente usados, seus potenciais mecanismos cardiotóxicos e os métodos de avaliação e monitorização da função cardíaca serão revistos. Destacaremos, também, potenciais estratégias preventivas e/ou de mitigação de doença cardiovascular nestas pacientes e discutiremos perspetivas futuras em Cardio-Oncologia. Em resumo, a abordagem da cardiotoxicidade permanece indefinida. Apesar da monitorização da FEVE, são necessárias diretrizes baseadas em evidências para otimização da prevenção e diagnóstico, melhorando a gestão da cardiotoxicidade pré-clínica e clínica, desenvolvimento de biomarcadores que permitam melhor estratificação de risco em estadio pré-clínico da cardiotoxicidade e uma definição universalmente aceite. Identificámos limitações e lacunas no conhecimento atual nomeadamente na aplicação dos biomarcadores, na monitorização da saúde cardiovascular durante a terapêutica do cancro, papel da profilaxia com fármacos cardioprotetores e na deteção de danos cardiovasculares latentes nos sobreviventes. Assim, a investigação deve procurar definir e uniformizar estratégias de abordagem, identificar biomarcadores mais precoces e sensíveis e esclarecer os mecanismos de cardiotoxicidade envolvidos. É igualmente importante a procura de evidência robusta na área da Cardio-Oncologia para apoio de decisões informadas acerca da terapia e diagnóstico precoce da doença cardiovascular.Breast cancer is the second most common cancer in women with an estimated 2.3 million new cases in 2020. Improvements in cancer survival rates in the last two decades due to treatment progress were accompanied by an increase of mainly cardiac adverse side effects, threatening to compromise the effectiveness of available therapies. Cardiotoxicity is one of the most significant adverse effects associated with anti-cancer agents used in breast cancer therapies. Its prevention, monitoring, diagnosis and treatment are crucial to improve prognosis. This dissertation aims to review the existing literature on cardiovascular toxicity associated with chemotherapy in breast cancer patients, addressing its most frequent adverse effects. The most frequently used cytotoxic agents, their potential cardiotoxic mechanisms and the methods for assessing and monitoring cardiac function will be reviewed. We will also highlight potential preventive and/or mitigation strategies of cardiovascular disease in these patients and future perspectives in Cardio-Oncology will be discussed. In summary, the assessment of cardiotoxicity remains indefinite. Despite LVEF monitoring, evidence-based guidelines are needed to optimize prevention and diagnosis improving preclinical and clinical cardiotoxicity management, the development of biomarkers that allow for better risk stratification in preclinical stages of cardiotoxicity and its universally accepted definition. We identified limitations and gaps on current knowledge concerning the applicability of biomarkers, on cardiovascular health monitoring during cancer therapy, the prophylactic role of cardioprotective drugs and in detecting latent cardiovascular damage in cancer survivors. Thus, investigation should seek to define and standardize strategies for assessing, earlier identification and more sensitive biomarkers and enlighten the mechanisms involved in cardiotoxicity. Equally important is the search for robust data in the field of Cardio-Oncology to support informed decisions concerning therapy and early diagnosis of cardiovascular disease

Perfil fonológico de crianças com perturbação de linguagem primária

Mestrado em Ciências da Fala e da AudiçãoApesar de se verificarem algumas diferenças quanto às frequências de ocorrência entre os subgrupos de estudo (por exemplo, os processos de oclusão e anteriorização são mais frequentes no grupo PCC 50%), de forma geral, o processo de desvozeamento de fricativas e os processos de estrutura silábica são os mais frequentes entre as crianças com PLP. Identificou-se ainda um conjunto de processos fonológicos (como por exemplo processos de posteriorização, substituições atípicas de consoantes e omissão de consoante inicial) considerados atípicos. A investigação desenvolvida permitiu, então, evidenciar que a população em estudo apresenta, para além de padrões típicos, mas persistentes, um conjunto de características que têm vindo a ser atribuídas à perturbação fonológica, como a existência de “plateaus” para aquisições precoces, a ocorrência de desencontro fonológico (“chronological mismatch”), onde se verifica a coocorrência de processos de fases precoces (como o processo de oclusão) e padrões de erros característicos de fases posteriores do desenvolvimento fonológico (como os processos de palatalização ou semivocalização de líquida) e ainda, a ocorrência de processos atípicos. Conclui-se, portanto, que as crianças com PLP apresentam um grande comprometimento na componente fonológica, o que vai de encontro ao defendido em recentes teorias explicativas da natureza desta perturbação da linguagem, que apontam para um défice inicial ou de especial proeminência nesta componente da linguagem. Estas conclusões sugerem que uma intervenção terapêutica adequada e focada na estimulação de competências fonológicas será essencial junto desta população. Apesar de se verificarem algumas diferenças quanto às frequências de ocorrência entre os subgrupos de estudo (por exemplo, os processos de oclusão e anteriorização são mais frequentes no grupo PCC 50%), de forma geral, o processo de desvozeamento de fricativas e os processos de estrutura silábica são os mais frequentes entre as crianças com PLP. Identificou-se ainda um conjunto de processos fonológicos (como por exemplo processos de posteriorização, substituições atípicas de consoantes e omissão de consoante inicial) considerados atípicos. A investigação desenvolvida permitiu, então, evidenciar que a população em estudo apresenta, para além de padrões típicos, mas persistentes, um conjunto de características que têm vindo a ser atribuídas à perturbação fonológica, como a existência de “plateaus” para aquisições precoces, a ocorrência de desencontro fonológico (“chronological mismatch”), onde se verifica a coocorrência de processos de fases precoces (como o processo de oclusão) e padrões de erros característicos de fases posteriores do desenvolvimento fonológico (como os processos de palatalização ou semivocalização de líquida) e ainda, a ocorrência de processos atípicos. Conclui-se, portanto, que as crianças com PLP apresentam um grande comprometimento na componente fonológica, o que vai de encontro ao defendido em recentes teorias explicativas da natureza desta perturbação da linguagem, que apontam para um défice inicial ou de especial proeminência nesta componente da linguagem. Estas conclusões sugerem que uma intervenção terapêutica adequada e focada na estimulação de competências fonológicas será essencial junto desta população.This study’s main goal is the phonological description of European Portuguese children with Primary Language Impairment (PLI)’s profile. A set of phonological parameters in 20 preschool children with PLI, divided in two subgroups according to their phonological impairment severity, namely the PCC 50% subgroup (9 children), was analysed. The study subgroups performance was compared with a group of 232 children with typical phonological development, aged between 3 and 5 years. Data was collected using a formal and standardised test – Teste Fonético Fonológico (TFF) ALPE - and analysed using the Automatic Phonological Analysis Tools (APAT) v.0.2.00. Results revealed that children with PLI, even when compared with the younger age range [3;0-3;6[, have a reduced phonetic consonantal and syllabic inventory, a lower Percentage of Vowels Correct (PVC) and PCC, not only in global terms but also for any manner of articulation (stops, nasals, fricatives, laterals and rhotics). Children with PLI also present different syllabic patterns and words structures, from those produced by typically developing children. While analysing these parameters, atypical patterns were also observed. such as: the acquisition order of the consonants in the phonetic inventory, with the appearance of phonemes acquired in later phases while others, of early acquisition, are not yet produced. “Plateaus” for early acquisitions, were also identified (for nasals and fricatives consonants), with the appearance of consonants of later phases, like the liquid. Children with PLI also produce a set of phonological processes beyond the disappearance expected age, namely, substitution processes of consonants and vowels, syllabic structure and assimilation processes. There were some differences between the study subgroups in terms of the relative frequency (for example, the stopping and fronting processes were more frequent in the PCC 50% group), generally, the fricatives devoicing process and the syllabic structure processes were the most frequent in children with PLI. A number of phonological processes considered atypical (for example, backing processes, atypical substitutions of consonants and the initial consonant deletion) were also identified in these children. Results revealed persistent typical patterns and also a set of characteristics that have been previously attributed to phonological impairment, like the existence of “plateaus” for the early acquisitions, the occurrence of chronological mismatch, where the subjects exhibit the co-occurrence of early phases processes (like stopping) and errors patterns characteristic of phonological development later phases (like palatalization or gliding) and even the occurrence of atypical processes. Children with PLI present considerable deficit in the phonological component, in accordance with recent explicative theories about the nature of PLI, which propose an initial deficit or the special prominence in this language component. These conclusions suggest that an adequate therapeutic intervention focused in the phonological competencies stimulation will be essential in this population

Efeito do autocriticismo na categorização de expressões faciais emocionais

Mestrado em Psicologia da Saúde e Reabilitação NeuropsicológicaO autocriticismo é uma forma de o indivíduo se avaliar e condenar a si próprio negativamente. A ativação e continuidade destes pensamentos aumenta a vulnerabilidade para a psicopatologia através de sentimentos como a derrota, a inferioridade, a subordinação, a rejeição, a vergonha e a ativação de comportamentos de defesa. O autocriticismo tem sido considerado um traço de personalidade associado a inúmeros comportamentos mal adaptativos. Vários estudos têm demonstrado que o processamento automático de sinais sociais ameaçadores contribui para a etiologia e manutenção de várias psicopatologias. Apesar de ser uma diferença individual que parece ser relevante no processamento de estímulos emocionais, o estudo de como os indivíduos autocríticos categorizam emoções nas expressões faciais nos outros é inexistente. Assim, o presente trabalho procura estudar o efeito do autocriticismo na categorização de expressões faciais emocionais, avaliando a proporção de respostas corretas e os níveis de morphing na categorização de emoções. A amostra foi constituída por sessenta estudantes universitários de ambos os sexos, distribuídos por dois grupos de acordo com a pontuação na Escala das Formas do Autocriticismo e Auto-Tranquilização que preenchiam. Assim, um grupo era constituído pelos indivíduos com baixos níveis de autocriticismo e o outro grupo era constituído pelos indivíduos com elevados níveis de autocriticismo. A tarefa consistiu na visualização de um vídeo com duração de 25s em que os participantes foram instruídos a carregar na barra de espaço e identificar a expressão emocional o mais rápido possível e que posteriormente selecionassem qual era a emoção apresentada no vídeo anterior. Cada uma das expressões emocionais apresentadas aumentava de intensidade à medida que o tempo ia passando. Os resultados evidenciaram um efeito de superioridade da alegria, ao verificar-se que os participantes cometeram menos erros e demoraram menos tempo a detetar a emoção de alegria. No entanto, no que diz respeito ao efeito principal de grupo e à interação deste com a emoção não se obtiveram diferenças significativas, quer na proporção de respostas corretas, quer nos níveis de morphing. Os resultados são congruentes com estudos que observam um efeito de superioridade da alegria, contudo mais estudos são necessários para explorar os vários fatores que contribuíram para a falta de mais resultados significativos na categorização de expressões faciais emocionais em função do autocriticismo.Self criticism is the way the individuals assess and condemn themselves negatively. The activation and continuation of these thoughts increases vulnerability to psychopathology through feelings like defeat, inferiority, subordination, rejection, shame and activation of defensive behaviors. The self-criticism has been considered a personality trait associated with numerous maladaptive behaviors. Several studies have shown that the automatic processing threatening social signals contribute to the etiology and maintenance of various psychopathologies. Despite being an individual difference that seems to be relevant in the processing of emotional stimuli, the study of how self-critics categorize emotions in facial expressions in others doesn’t exist. The aim of this paper was to analyze the effect of self-criticism in the categorization of emotional facial expressions, evaluating the proportion of correct answers and the morphing levels in the categorization of emotions. Sixty college students of both genders were divided into two groups according to scores on the Forms Of Self Criticising & Self Reassuring scale. One of the groups was composed with patients with low levels of self-criticism and the other group was composed with patients with elevated levels of self-criticism. The task consisted of watching a video lasting 25s in which participants were instructed to press the space bar and identify the emotional expression as quickly as possible and then select what emotion was represented in the previous video. The intensity of the emotional expression was increasing as long as time passed. The results showed a happiness superiority effect, showing that the participants had less errors and took less time to sense the emotion of happiness. However, there wasn’t a significant effect for group and for the interaction neither in the proportions of correct answers neither in the levels of morphing. The results are consistent with studies that showed a superiority effect of happiness, but more studies are needed to explore the various factors that contributed to the lack of significant results in the categorization of emotional facial expressions related to self-criticis

Ecophysiological characterization of metallophyte species candidates for phytoremediation

Tese de mestrado em Biologia dos Recursos Vegetais, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020A mais extensa área metalífera da Península Ibérica, de nome Faixa Piritosa Ibérica (FPI), abrange parte de Portugal e Espanha. Atualmente, na zona portuguesa da FPI, existem apenas duas minas ativas: Aljustrel e Neves Corvo. Esta última encontra-se localizada na povoação de Santa Bárbara de Padrões. Até há poucas décadas, a atividade mineira desta formação vulcano-sedimentar era bastante intensa, no entanto tem vindo a diminuir. Como resultado deste decréscimo de atividade, existem hoje diversas minas abandonadas, como é o caso da mina de São Domingos. Além disso, uma outra consequência da atividade intensa diz respeito à degradação ambiental, causada acima de tudo por elevados níveis de poluição, nomeadamente poeiras, águas ácidas, erosão, entre outros. Estes locais apresentam um ambiente inóspito para a maioria das espécies. Existem, no entanto, algumas espécies - vegetais e não só - que conseguem tolerar as contaminações elevadas de metais tóxicos e pH ácido do solo. Estes organismos possuem adaptações fisiológicas que lhes garantem não apenas a sobrevivência, mas também a reprodução em ambientes metalíferos, sendo designadas, em face disso, de espécies metalófitas. Uma vantagem adicional da maior parte destas espécies passa pela contribuição para uma diminuição da biodisponibilidade de metais tóxicos através de processos de fitorremediação. Desta forma, para o sucesso de projetos de restauro ecológico que se venham a realizar, é essencial que os mesmos tenham em consideração a existência das espécies vegetais presentes nesse local. Um projeto de restauro ecológico que integre as espécies metalófitas vegetais provenientes do mesmo local terá fortes probabilidades de alcançar o Objetivo de Desenvolvimento Sustentável 15 das Nações Unidas – Mineração e Proteção à Vida Terrestre. Este trabalho teve por base dois objetivos, ambos relacionados com oito espécies vegetais presentes na zona da mina de S. Domingos. O primeiro foi avaliar o desempenho fisiológico dessas espécies e o segundo foi avaliar o nicho ecológico das mesmas. As espécies em questão foram: Agrostis castellana, Anarrhinum bellidifolium, Cistus ladanifer, Cistus salviifolius, Cistus monspeliensis, Erica andevalensis, Erica australis and Lavandula stoechas. Como tal, foram realizados dois tipos de testes: um em estufa e outro no local. Ambos os testes foram realizados utilizando o pH como indicador de contaminação. Isto porque, os minérios descobertos, em contacto com a água e o ar, são submetidos a um processo de hidrólise. A hidrólise é um processo químico que causa a diminuição do pH, pelo que podemos inferir que o aumento da concentração de metais tóxicos está correlacionado com um pH mais acído. Os testes de estufa consistiram na germinação de sementes das oito espécies escolhidas, sementes essas que foram submetidas a dois pré-tratamentos de calor em quatro substratos de diferentes graus de contaminação, designadamente: comercial, mistura (combinação comercial:contaminado 1 50%:50%), contaminado 1 e contaminado 2. Os substratos contaminados utilizados, designados contaminado 1 e contaminado 2 são originários das minas de S. Domingos e Santa Bárbara de Padrões, respectivamente. A mina de São Domingos encontra-se atualmente abandonada, situação que se verifica desde 1966. Por sua vez, Santa Bárbara de Padrões é, presentemente, uma povoação afetada pelas poeiras derivadas da mina ativa Neves Corvo, que ainda se encontra em atividade. O solo proveniente desta povoação tem uma contaminação bastante inferior ao da mina de S. Domingos. Apesar de pertencerem a formações litológicas diferentes, estas duas minas encontram-se na zona da Faixa Piritosa Ibérica. Como tal, crêse que esta razão nos permite justificar o uso de ambos os solos para avaliar se as espécies em causa poderão ser utilizadas em programas de restauro de outras minas, também localizadas na mesma zona. Em cada tratamento, foi escolhido apenas um indivíduo sobrevivente, que foi seguido fisiologicamente através de dois parâmetros – altura e refletância das folhas. Para o efeito, foram usados três índices, tais como: Normalized Difference Vegetation Index (NDVI), Photochemical Reflectance Index (PRI) e Chlorophyll (CHL). Os testes levados a cabo no local consistiram em três transectos, realizados em quatro áreas de amostragem ao longo da mina de S. Domingos. As espécies de interesse que foram intercetadas nestes transectos, posicionados ao longo de um gradiente de pH, tiveram diferentes medidas fisiológicas tais como: altura, cobertura e refletância das folhas. Para além disso, os substratos dos testes da estufa, assim como os solos recolhidos nos transectos, foram caracterizados a nível de pH, matéria orgânica, granulometria e condutividade elétrica. No geral, observou-se que as espécies estudadas tendem a preferir solos acídicos, ainda que com um valor de pH superior ao encontrado na mina de S. Domingos (substrato mistura). As espécies não demonstraram alterações fisiológicas significativas entre diferentes pHs, o que poderá indicar que, como as espécies já estão adaptadas às pressões existentes, a variação destas não afeta a performance fisiológica. No entanto, o mesmo não se aplica ao desempenho ecológico. Foi constatado que, neste aspeto, a performance ecológica de algumas espécies foi afetada, especificamente, em relação à restrição do nicho. Em particular, a espécie E. andevalensis foi a que demonstrou maior adaptação ao pH mais ácido. Contudo, isto verificou-se apenas para o caso dos substratos provenientes da mina de S. Domingos, dado que as plantas não germinaram nos substratos comercial e contaminado 2, proveniente de Santa Bárbara de Padrões. Adicionalmente, esta foi a única espécie a conseguir estabelecer-se no substrato contaminado 1. Ecologicamente, foi observado que esta espécie tende a estar presente nas margens dos corpos de água com origem em Drenagem Ácida de Minas (DAM), cujo pH rondou o valor 2.5, ou junto a zonas de escorrência, sendo possível constatar que esta restrição do seu nicho poderá ser provocado devido à presença de outras espécies como, por exemplo, a C. ladanifer. No que diz respeito à C. monspeliensis e à E. australis, estas foram as espécies com menor número de indivíduos estabelecidos. Contudo, a espécie C. monspeliensis foi a que demonstrou menor viabilidade de germinação. Não foi possível encontrar uma razão específica para este resultado. Haverá várias hipóteses que o possam justificar, entre elas, a amostragem precoce das sementes que poderá ter inviabilizado a maturação destas. Localmente, C. ladanifer foi a espécie dominante da área da mina. No entanto apenas se conseguiu estabelecer nos substratos comercial e mistura, neste último substrato com um indivíduo com valor superior de NDVI. Em relação a L. stoechas e A. bellidifolium, estas duas espécies estabeleceram-se com sucesso nos substratos comercial e mistura e, no geral, mantiveram o desempenho fisiológico estável. Localmente, A. bellidifolium foi a espécie com menor cobertura. A espécie A. castellana foi a que demonstrou maior plasticidade de habitat, uma vez que foi a única a conseguir estabelecer-se no substrato contaminado 2, com valores superiores nos três índices para as plantas sobreviventes. Esta espécie da família Poaceae é, das oito espécies estudadas, a candidata com maior potencial para eventuais ações de cobertura vegetativa a efetuar noutras áreas mineiras, para além da mina de S. Domingos. Adicionalmente, com base nestes testes, foi possível verificar que a competição entre espécies é um fator mais forte e determinante do que a contaminação, dado que as espécies encontradas localmente já se encontram adaptadas ao grau de contaminação existente. Devido a tudo o que foi exposto acima, este projeto contribuiu para o aumento do conhecimento sobre os desempenhos ecológico e fisiológico das oito espécies escolhidas, que habitam esta área metalífera e que poderão ser utilizadas em futuros projetos de restauro ecológico na mina de S. Domingos.The largest metalliferous area in the Iberian Peninsula, known as Iberian Pyrite Belt, is now an area with several abandoned mines whose intense mining activity has resulted in a degraded environment with serious pollution problems, such as dust, acid mine drainage, tailings, soil heaps and others. Although these sites exhibit an inhospitable environment for most species, there are plant species that tolerate high contaminations of toxic metals and the low soil pH. These so called metallophyte species have physiological adaptations that allow them to survive, establish and reproduce in metalliferous environments. Moreover, most of these species contribute with phytoremediation processes and thus decreasing the bioavailability of toxic metals. For these reasons, ecological restoration of these sites should take in account the use of the already present vegetation. Furthermore, with an increase of the aridity in Portuguese Iberian Pyrite Belt, it’s essential to increase the resilience of these sites and this can be achieved by considering the United Nation’s Sustainable Development Goal 15 – Mining and Life on Land. The aim of this work was to determine the ecological niche and the physiological performance of eight plant species present in São Domingos mine: Erica australis, Erica andevalensis, Lavandula stoechas, Cistus ladanifer, Cistus salviifolius, Cistus monspeliensis, Agrostis castellana and Anarrhinum bellidifolium. To accomplish this, two types of experiments were held: greenhouse and insitu tests; using the pH as a proxy for contamination. Greenhouse tests focused of germination and further following of physiological parameters (height and reflectance) on four contamination level’s substrates: commercial, mixed, contaminated 1 (from São Domingos mine) and contaminated 2 (from Santa Bárbara de Padrões). In-situ characterization was achieved by using line-intercept transects in four areas to register the cover, height and reflectance. In addition, the soils from the greenhouse tests and the in-situ points where characterized in pH, organic matter, electrical conductivity and granulometry. Generally, the results indicated a preference for the mixed substrate (amended with commercial substrate) and a general physiological adaptation to the toxic metals contamination and low pH. E. andevalensis was the species that withstand lowest values such as pH≈2.5. Furthermore, as these species are already adapted to the extreme characteristics of the mining area, this work concluded that the competition was a stronger driver than the pH, especially for the Erica sp. and Cistus sp. Therefore, this project has contributed to increase knowledge about the ecophysiological performance of the species that inhabit metalliferous areas, to support future ecological restoration projects of the polluted zones degraded by the mining industry

Immunotherapy in melanoma : the role of nk cells

RESUMO: O melanoma é o quinto tumor maligno mais comum nos homens (sétimo nas mulheres) e a sua incidência está a aumentar mais rapidamente do que a de qualquer outro cancro. É o tipo de cancro cutâneo mais agressivo; corresponde a apenas 2% de todos os cancros de pele, mas é responsável por mais de 70% das mortes causadas pelo cancro cutâneo. O melanoma responde mal à terapia sistémica e tem mau prognóstico nos doentes com metástases à distância, com uma taxa de sobrevivência global aos 2 anos que varia entre os 18 e os 40%. No contexto do cancro identificamos duas respostas imunológicas opostas: uma resposta aguda anti-tumoral com predomínio de células Th1 podendo, consequentemente, levar a uma reacção auto-imune; e uma resposta inflamatória pró-tumoral, caracterizada por uma tolerância imunológica através de mecanismos imunossupressores. Durante a progressão do tumor verifica-se um desequilíbrio com um predomínio da resposta inflamatória pró-tumoral e disfunção das células anti-tumorais Th1. O conceito de "exaustão dos linfócitos T” tem sido desenvolvido nos últimos anos e pode explicar a disfunção das células Th1. Este conceito de "exaustão dos linfócitos T", consequência do microambiente tumoral ou de outros factores, foi descrita pela primeira vez em doenças infecciosas crónicas e mais recentemente em diferentes tipos de cancro, em particular no melanoma. Este fenótipo é caracterizado pela perda progressiva da capacidade de proliferação, do potencial citotóxico e da capacidade de produzir interleucina 2 (IL-2). A “exaustão dos linfócitos T” no contexto do cancro metastático tem sido reforçado pelo recente sucesso de imunoterapias dirigidas aos marcadores de exaustão expressados pelos linfócitos T, incluindo o CTLA-4 e o PD-1, em doentes com melanoma avançado. No entanto, o fenótipo e a função das NK em diferentes fases da progressão do tumor e a sua relação com fatores de prognóstico ainda é desconhecida. As células NK pertencem ao sistema imune inato e têm um papel importante na resposta antitumoral. A função destas células depende do equilíbrio entre os receptores de activação e de inibição, e da expressão dos respectivos ligandos no microambiente tumoral. O Tim-3, outro marcador de exaustão dos linfócitos T juntamente com o CTLA-4 e o PD-1, comporta-se como um receptor inibitório nos linfócitos T e tem um papel fundamental para a manutenção da tolerância imunológica. O Tim-3 também é expresso nas células NK, no entanto o seu papel na modulação da função destas células permanece pouco claro, em particular no contexto do cancro. Os objetivos deste estudo foram: caracterizar o fenótipo e a função das células NK em doentes com melanoma; identificar moléculas, que possam estar envolvidas no mecanismo da exaustão das células NK, como potenciais marcadores de prognóstico no melanoma; definir o papel do Tim-3 expresso nas células NK de doentes com melanoma avançado; e estudar o efeito do bloqueio de checkpoints imunológicos no fenótipo e função das células NK no contexto dos doentes com melanoma avançado. Os nossos dados mostraram que as células NK de doentes com melanoma avançado exibem um fenótipo de exaustão imunológica que é caracterizado por uma expressão aumentada dos receptores inibitórios KIR3DL1 e KIR2DL3, por uma expressão diminuida dos receptores de activação NKG2D, NKp46 e DNAM-1, por uma resposta deficiente à estimulação com IL-2, por uma regulação negativa dos fatores de transcrição T-bet e Eomes, e por um défice de função (citotoxicidade, produção de IFN-γ e proliferação). As células NK adquirem gradualmente este fenótipo de exaustão imunológica à medida que a doença avança dos estadios iniciais (estadios I e II) para estadios mais avançados (estadios III e IV). Curiosamente, este fenótipo de exaustão das células NK está associado as parâmetros clinico-patológicos com valor prognóstico conhecido, como a espessura e a presença/ausência de metástases (regionais e à distância). Além disso, níveis elevados de MICA solúvel (ligando do receptor NKG2D) no plasma podem estar envolvidos no mecanismo de exaustão das células NK e identificam doentes com sobrevivência global e tempo de livre de doença mais curtos. Neste trabalho também identificamos o Tim-3 como um receptor inibitório e com uma expressão aumentada nas células NK de doentes com melanoma avançado, e que desempenha um papel chave no fenótipo de exaustão destas células. Mais importante, mostramos ainda que o bloqueio do receptor Tim-3 consegue reveter, em parte, este fenótipo de exaustão, com um aumento da citotoxicidade em 20%, da produção de IFN-γ em 15% e da proliferação em 60%. Finalmente, caracterizamos o efeito do ipilimumab (anti-CTLA-4) no fenótipo de exaustão das células NK de doentes com melanoma avançado. Notavelmente, as células NK de doentesrespondedores ao tratamento com ipilimumab apresentaram níveis mais elevados de IL-2R e, por conseguinte, maior citotoxicidade em resposta à estimulação com IL-2. Estes dados abrem caminho para novas estratégias terapêuticas com base nas células NK, incluindo o bloqueio do receptor Tim-3 no contexto de melanoma. Além disso, uma melhor compreensão do mecanismo subjacente à exaustão das células NK irá definir novos marcadores de prognóstico e estratégias terapêuticas.ABSTRACT: Melanoma is the fifth most common cancer in men (seventh in women) and its incidence is increasing more rapidly than that of any other malignancy. It is the most aggressive type of skin cancer; although it accounts for 2% of all skin cancers it leads to more than 70% of their deaths. In fact, melanoma responds poorly to systemic therapy and the overall prognosis of patients with distant metastasized melanoma remains poor; the 2-year overall survival rate ranges from 18 to 40%. In the context of cancer two opposite immune responses exist: an acute T helper (Th) 1 antitumoral response that requires a substantial autoimmune attack; and a pro-tumorigenic inflammatory response, characterized by an immune tolerance via active immunosuppressive mechanisms. During tumor progression there is an imbalance with a stronger pro-tumorigenic inflammatory response, while the anti-tumoral Th1 cells display a dysfunctional phenotype. The new concept of “T cell exhaustion”, that has been developped in the past few years, can explain T cell dysfunction. This “T cell exhaustion”, either caused by environmental influence or other factors, was first described in chronic infectious diseases and more recently in different types of cancer, particularly in melanoma. This phenotype is characterized by early loss of proliferative capacity, cytotoxic potential, and the ability to produce interleukin (IL)-2. The concept of T cell exhaustion in the context of metastatic cancer has been reinforced by the recent success of immunotherapies targeting the exhaustion markers cytotoxic Tlymphocyte- associated protein 4 (CTLA-4) and programmed (cell) death 1 (PD-1) in advanced melanoma. However, the phenotype and function of natural killer (NK) cells in different phases of tumor progression and their relationship with prognostic factors is still unknown. NK cells are innate immune cells, prone to target tumor cells, whose function depends on the balance between activating and inhibitory receptors, and on the expression of the respective ligands in their microenvironment. T cell immunoglobulin domain and mucin domain 3 (Tim- 3), another T cell exhaustion marker along with CTLA-4 and PD-1, behaves as an inhibitory receptor in T cells and is key in the maintenance of immune tolerance. Tim-3 is also expressed in NK cells; however its role in modulating the function of these innate effector cells remains unclear, particularly in human disease. The aims of this study were: to characterize the phenotype and function of NK cells from melanoma patients; to identify potential players in the mechanism of NK cell exhaustion as prognostic markers; to define the role of Tim-3 expression in NK cells from advanced melanoma patients; and to study the effect of checkpoint blockade in NK cell phenotype and function in the context of advanced melanoma patients. Our data showed that NK cells from patients with advanced melanoma display an exhausted phenotype that is characterized by upregulation of inhibitory receptors (Killer cell Immunoglobulin-like receptor 3DL1 and 2DL3 - KIR3DL1 and KIR2DL3, respectively), downregulation of activating receptors (natural-killer group 2D (NKG2D), natural killer p46 (NKp46) and DNAX accessory molecule-1 (DNAM-1)), unresponsiveness to IL-2 stimulation, downregulation of the transcription factors T-box (T-bet) and eomesodermin (Eomes), and defective function. The latter includes the main NK cell functions, cytotoxicity, interferon gamma (IFN-γ) production and proliferation. NK cells acquire this exhausted phenotype gradually as disease advances from early (stages I and II) to later stages (stages III and IV). Moreover, the exhaustion of NK cells is associated with clinicopathological parameters that have known prognostic value, such as thickness and presence/absence of metastases (regional and distant). In addition, high serum levels of soluble MHC class I chain-related genes A (sMICA), an NKG2D ligand (NKG2DL) that may be involved in the mechanism of NK cell exhaustion, identify patients with shorter diseasefree and overall survival. We also identified Tim-3 as an inhibitory receptor over-expressed in NK cells from advanced melanoma patients that plays a key role in the exhausted phenotype of these cells. Significantly, we demonstrated that Tim-3 blockade partially reversed this exhausted phenotype. Therefore, in average, it was possible to enhance cytotoxicity by 20%, IFNγ production by 15% and proliferation by 60%. Finally, we characterized the effect of ipilimumab (anti-CTLA-4) on exhausted NK cells from advanced melanoma patients. Remarkably, NK cells from responders to ipilimumab treatment have higher levels of IL-2 receptor (IL-2R), and consequently, are more responsive to IL-2 stimulation and more cytotoxic.These data open exciting avenues for new NK cell-based therapies, including targeting Tim-3 in the context of melanoma. Moreover, a better understanding of the mechanism behind NK cell exhaustion will help defining new prognostic markers and therapeutic strategies

Molecular mechanisms and relevance of the nuclear internalization of VEGF and VEGFR2 (KDR) on endothelial cells

Tese de doutoramento, Biologia (Biologia Celular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011The angiogenic growth of new blood vessels from pre-existing ones is fundamental during embryonic development and for normal homeostasis of adult tissues. Vascularization ensures the delivery of oxygen and nutrients essential for organ growth and repair. Under physiological conditions, a fine balance between stimulators and inhibitors regulates the complex process of angiogenesis. However, in pathological conditions as tumor progression, the stimulus becomes excessive and induces an angiogenic switch that results in the uncontrolled growth of blood vessels that facilitates tumor growth and metastasis. The VEGF/VEGFRs system is a potent regulator of the angiogenic response in endothelial cells (ECs). VEGF binds and activates its tyrosine kinase receptors VEGFR1 and VEGFR2 at the surface of ECs. In contrast to VEGFR1, VEGFR2 has a potent tyrosine kinase activity and is considered the major mediator of the signaling responses induced by VEGF. VEGFR2 phosphorylation at the cell membrane induces the activation of intracellular signaling cascades that regulate a wide range of biological responses including survival, proliferation, migration and permeability. The molecular bases of these processes have been the focus of intensive work for the last 40 years. Moreover, the discovery of the presence of VEGF and VEGFR2 not only at the cell surface but also intracellularly, in particular in the cell nucleus, has opened the possibility for new mechanisms of VEGF/VEGFR2 activity. In this work we focused on the molecular basis and relevance of the nuclear internalization of VEGF and VEGFR2 in ECs. We demonstrated that upon VEGF stimulation, both VEGF and VEGFR2 are internalized to the nucleus in a VEGFR1-mediated process required for EC recovery following in vitro wounding. We also showed that the VEGF/VEGFR2 internalization is mediated via caveolae-mediated endocytosis and microtubules and requires the activation of the PI3K pathway. By generating several VEGFR2 deletion mutants in tyrosine residues we demonstrated that VEGFR2 internalization required its phosphorylation. In addition, we showed the importance of the tyrosine residue Y951 for the nuclear internalization of VEGFR2. Having established the molecular basis for this nuclear internalization process, we focused on the role of VEGFR2 in the nucleus. We showed that VEGFR2 interacts with the Sp1 transcription factor. We also demonstrated that VEGFR2 binds to the Sp1-responsive region of the VEGFR2 proximal promoter and that the VEGFR2 binding to DNA is linked to the transcriptional activation of the VEGFR2 promoter. This previously unrecognized function of nuclear VEGFR2 as a putative transcription factor involved in the regulation of its own transcription is a novel mechanism for the amplification of the angiogenic response and can be crucial to develop new therapeutic approaches associated with angiogenesis-dependent diseases.O crescimento de vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes. Angiogénese é um processo fundamental durante o desenvolvimento embrionário e que contribui também para a homeostasia dos tecidos adultos. A vascularização assegura o fornecimento de oxigénio e nutrientes, essenciais para o crescimento e reparação dos órgãos. Todos os vasos sanguíneos são revestidos por uma monocamada de células endoteliais vasculares, considerada um componente essencial no processo angiogénico, uma vez que em resposta a diferentes estímulos, as células endoteliais migram e proliferam estabelecendo novos vasos sanguíneos. Em condições fisiológicas a angiogénese é regulada por um balanço crítico entre factores estimuladores (pró-angiogénicos) e inibidores (anti-angiogénicos). No entanto, em condições patológicas, como durante o crescimento tumoral, o excesso de moléculas estimuladoras induz o crescimento descontrolado de vasos sanguíneos facilitando a progressão tumoral e a disseminação de metástases. O factor de crescimento do endotélio vascular (VEGF) é um dos reguladores mais importantes da resposta angiogénica em células endoteliais vasculares. O VEGF é produzido pela maioria das células do organismo em resposta a diferentes estímulos como a hipoxia e actua maioritariamente nas células endoteliais vasculares promovendo a sobrevivência, proliferação e migração destas células. Os efeitos biológicos do VEGF são mediados por meio de dois diferentes receptores cinase de tirosina, específicos e expressos na superfície destas células: o receptor 1 e 2 designados por VEGFR1 (ou FLT1) e VEGFR2 (ou KDR). Estudos genéticos demonstraram que tanto o VEGF como os seus receptores são necessários para o desenvolvimento normal do sistema vascular. Os embriões de murganhos deficitários em qualquer um destes genes apresentam letalidade entre os dias E8.5-12.5 do desenvolvimento embrionário manifestando graves deficiências na formação inicial dos vasos sanguíneos. Diferentes estudos mostraram que apesar da afinidade do VEGF ser superior para VEGFR1 relativamente a VEGFR2, é a activação do segundo que é responsável pelos efeitos mediados pelo VEGF nas células endoteliais. O modo de acção do VEGF é classicamente descrito através da sua ligação ao domínio extracelular do VEGFR2, induzindo a sua dimerizaçao e a auto-fosforilaçao de resíduos de tirosina específicos no domínio intracelular do receptor. A fosforilaçao destes resíduos gera locais de ligação e activação de mensageiros secundários que induzem a activação de diferentes vias de transdução de sinal e consequentemente a respostas celulares específicas como a proliferação, migração, sobrevivência e permeabilidade. Os mecanismos moleculares de acção do VEGF e VEGFR2 têm sido alvo de numerosos estudos nos últimos 40 anos. Recentemente, diferentes publicações mostraram que para além da localização na superfície celular, o VEGF e VEGFR2 são também detectados no núcleo nomeadamente em tecidos e células leucémicas, in vitro e in vivo. Outros trabalhos mostraram a presença de VEGFR2 no núcleo de células endoteliais de rato ou bovino. Estas observações abriram, sem dúvida, a possibilidade de novos mecanismos de acção exercidos por estas moléculas. Assim, no decorrer deste trabalho focámo-nos na investigação dos mecanismos moleculares de internalização nuclear do VEGF e VEGFR2 nas células endoteliais humanas e na relevância funcional deste processo. Na primeira parte deste trabalho, demonstrámos que após um estímulo de VEGF, tanto o VEGF como o VEGFR2 são internalizados para o núcleo da célula endotelial, num processo dependente de VEGFR1. Verificámos que esta mesma internalização é necessária para a reconstituição de uma monocamada endotelial após a indução de feridas in vitro. Estes resultados revelaram uma nova função biológica já anteriormente descrita dos dois receptores de VEGF. Os nossos resultados mostraram também que no processo de internalização é necessária a activação da via de sinalização de PI3K, e que o mesmo envolve a endocitose mediada por caveolina-1, usando os microtúbulos como motores. Para além disto, através da construção de mutantes truncados em diferentes resíduos de tirosina na região intracelular do VEGFR2, demonstrámos que a fosforilação/activação do VEGFR2 é crucial para a translocação nuclear observada. Com o objectivo de identificar quais os resíduos de tirosina envolvidos na translocação do receptor, construímos várias proteínas de fusão VEGFR2-GFP usando o VEGFR2 nativo ou formas mutadas de VEGFR2; nestas um ou dois resíduos de tirosina foram convertidos em resíduos de fenilalanina e testámos a sua capacidade de serem internalizados para o núcleo de células endoteliais por ensaios de microscopia denominados Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). Os nossos resultados demonstraram que o resíduo de tirosina Y951 (localizado em um dos domínios intracelulares do receptor), tem uma função importante na translocação nuclear do VEGFR2. Na segunda parte deste trabalho focámo-nos na investigação da função do receptor VEGFR2 no núcleo das células endoteliais. Num modelo endotelial.de sobreexpressão de VEGFR2, os nossos resultados mostraram que a sobreexpressão nuclear de VEGFR2 estava correlacionada com a expressão ou actividade de várias proteínas nucleares. O envolvimento de VEGFR2 na actividade transcricional também foi sugerido em ensaios de incorporação de 5-FU, em que demonstrámos que os níveis de transcrição celulares estavam diminuídos e correlacionados com a diminuição dos níveis nucleares de VEGFR2. Por análise de espectrometria de massa os nossos resultados mostraram que em células endoteliais, o VEGFR2 nuclear interage com diferentes proteínas nucleares. Confirmámos a interacção de VEGFR2 com o factor de transcrição Sp1, envolvido na regulação de diferentes genes importantes para a resposta angiogénica. Através de ensaios de imunoprecipitaçao da cromatina (ChIP), mostrámos que o VEGFR2 se liga a uma região do seu próprio promotor e à qual também se liga Sp1. Estes resultados foram confirmados por ensaios de interacção DNA-proteína (EMSA), em que se utilizou a mesma região do promotor de VEGFR2. Contudo, os nossos resultados não permitem definir se VEGFR2 se liga ao seu promotor interagindo com Sp1. Verificámos ainda que a ligação de VEGFR2 ao seu promotor está associada à sua activação transcricional. Ensaios repórter usando luciferase, realizados em células 3T3 que permitiu-nos identificar a região entre -300/-116 (relativamente ao local de início da transcrição), como essencial para conferir a actividade transcricional dependente de VEGFR2. Para além destes resultados, e por meio de ensaios de ChIP, mostrámos que a ligação de VEGFR2 ao DNA é dependente da activação por VEGF, assim como a sua translocação nuclear. Por último e reforçando as observações acima descritas, verificámos também que a igação de VEGFR2 ao seu próprio promotor é bloqueada pelo tratamento com Bevacizumab ou Sunitinib, dois agentes anti-angiogénicos que inibem a activação de VEGFR2. O nosso trabalho revela uma nova função do VEGFR2, como um factor de transcrição envolvido na regulação da sua própria transcrição e sugere que este poderá estar implicado na regulação de outros genes importantes para a amplificação da resposta angiogénica. Diferentes estratégias terapêuticas têm vindo a ser desenvolvidas com o objectivo de bloquear a activação de VEGFR2, enquanto proteína membranar. Contudo, estes inibidores angiogénicos não são efectivos em todos os tumores e o benefício é modesto, mesmo para os doentes que inicialmente respondem de forma favorável à terapêutica, indicando que existem mecanismos de resistência à terapia anti- VEGF. A análise da actividade transcricional de VEGFR2 nestes tumores e a identificação de genes regulados por esta proteína irão certamente contribuir para uma maior compreensão da sua função na angiogénese tumoral e na descoberta de novos alvos terapêuticos.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/27505/2006 e programa POPH/FSE

Do não-lugar ao sagrado – Espaço ecuménico

O ser humano vive num mundo em constante transformação, o que afecta a estrutura e/ou funcionamento da sociedade, modificando assim o desenrolar da história. Desde os princípios da civilização que o triângulo Espiritismo, Arquitetura e Sociedade cresceu e evoluiu paralelamente. Foi para agradar e disseminar vários deuses e crenças que se construíram os maiores e mais importantes edifícios. Porém, só depois do fim da Idade Média começam a aparecer os primeiros focos de aceitação de Sectarismo Religioso, assistindo-se assim a um fenómeno cultural que origina um processo de multiplicidades, transformando o comportamento do homem na sociedade. O pluralismo religioso assume-se na sociedade e confronta o ser humano com uma diversidade de doutrinas, levando-o a (con)viver de forma respeitadora e tolerante com a diferença. Surge o ecumenismo como movimento que se destina à unificação de igrejas cristãs, na demanda da resolução de um problema transversal aos diferentes credos, atenuando os conflitos consequentes de um preconceito irracional inerente ao homem. Reflecte-se sobre a partilha de um espaço de reflexão e prática religiosa, denominado ecuménico, que pretende superar as divisões entre as diferentes igrejas e, consequentemente, as divergências históricas, políticas e culturais. Esta dissertação apresenta uma componente teórica que aborda conceitos e princípios de base relativos ao não-lugar e ao espaço. Pretende estabelecer uma relação entre o homem e o lugar da sobremodernidade associando a dicotomia do não lugar/espaço. A análise e interpretação destes conhecimentos fundamentam uma proposta de arquitetura com objectivos funcionais e formais. Desta forma, será apresentada uma hipótese de intervenção não só em termos arquitectónicos mas também sociais.The human being lives in the world are in constant transformation, which affects the structure and functioning of societies and modifying the path of history. Since the beginning of civilization the triangle: Spiritism and Architecture and Society grow and develop in parallel. It has been to please and feast many gods and believes that the largest and most important buildings were built for. However, it is only after the end of the Middle Ages that the first speckles of acceptance of Religious Sectarianism begin to appear, what let us witness a cultural phenomenon that leads to a process of multiplicities which transforms human being's behavior in the society. Religious pluralism assumes itself in society and confronts the human being with a diversity of doctrines, leading its to live in a respectful and tolerant way with differences. Ecumenism emerges as a movement aimed at the unification of Christian churches, in order to solve a problem that transcends the different creeds, mitigating the consequent conflicts of an irrational prejudice inherent to humans. It reflects on the sharing of a space of meditation and religious practice, called ecumenical, which seeks to overcome divisions between different believes and consequently historical and political and cultural divergences. This dissertation presents a theoretical component that addresses basic concepts and principles related to non-place and space. It seeks to establish a relationship between man and the place of over-modernity by associating the dichotomy of non-place/space. The analysis and interpretation of this knowledge base a proposal of architecture with functional and formal objectives. In this way, a hypothesis of intervention will be presented not only in architectonic but also social terms

Melhoria de um armazém de produto acabado

Mestrado em Engenharia e Gestão IndustrialO presente trabalho resultou da realização de um estágio curricular na empresa Oliveira & Irmão sediada em Aveiro, Portugal. O trabalho incide num conjunto de ações de melhoria contínua que visam melhorar a eficiência dos operadores quanto à operação de carga, a melhoria da qualidade de trabalho e consequentemente a eliminação de desperdícios. O principal objetivo passa por eliminar os principais desperdícios no armazém de produto acabado. Para isso, foram utilizadas ferramentas Lean e da Qualidade, nomeadamente o diagrama de Ishikawa para identificar as causas raiz dos problemas. Este documento descreve um trabalho de gestão do armazém de expedição, inserido no departamento logístico, que pretende, essencialmente, melhorar processos de arrumação, armazenamento, recolha de artigos e seu carregamento. Centra-se, sobretudo, na mudança de Layout, na melhoria da eficiência dos operadores e na introdução de localizações no armazém.This paper is the result of a traineeship in the company Oliveira & Irmão. The project focuses on a set of improvement actions that aim to improve the operators' efficiency, improve the quality of work and waste disposal. In this context, its main objective involves eliminating the main waste in the finished product warehouse. For this purpose, Lean and Quality Tools were used, for example the Ishikawa diagram to identify the root causes of the main problem. This document consists in a management work of the shipping warehouse, inserted in the logistics department that is essentially used to optimize processes, collection of items and loading. This paper focus mainly in layout change, improvement of the operators efficiency and introducing of locations in the warehouse

Contraste leiteiro: ferramenta de monitorização para uma maior eficiência das explorações de bovinos leiteiros

Os resultados do contraste leiteiro são uma ferramenta de gestão. Desequilíbrios nutricionais, metabólicos e infecciosos podem ser diagnosticados pela concentração de β-hidroxibutirato(BHB), azoto ureico(MUN), gordura, proteína, relação gordura/proteína e células somáticas(SCC) do leite. O objetivo é avaliar a variação destes parâmetros segundo fatores não-nutricionais e a inter-relação entre estes. Analisou-se 110461 amostras de 9523 vacas recolhidas mensalmente entre janeiro de 2015 e março de 2017 em 27 efetivos do sul de Portugal. Ajustou-se dois modelos lineares generalizados mistos para determinar os fatores associados à concentração de BHB e MUN serem superiores a 0,2mmol/L e 300mg/kg, respetivamente. Verificou-se um considerável efeito dos fatores não-nutricionais, embora variável consoante o fator e o parâmetro. Os modelos demonstraram que a produção de leite, fase e número de lactação e a relação gordura/proteína influenciam a concentração de BHB e MUN. A concentração de BHB também é influenciada pela SCC e gordura, a MUN pela proteína; MILK RECORDING: MONITORING TOOL FOR GREATER DAIRY FARMS EFFICIENCY ABSTRACT: Milk recording results are a management tool. Nutritional, metabolic and infectious disorders can be diagnosed by β-hydroxybutyrate(BHB), milk urea nitrogen(MUN), fat, protein, relation fat/protein and somatic cells concentration in milk. The objective is analyzed the variation of these parameters according to non-nutritional factors and the interrelation between them. This study analyzed 110,461 samples of 9,523 cows collected monthly from January 2015 to March 2017 from 27 herds of South of Portugal. Two generalized linear mixed regression models were constructed to determine non-nutritional factors associated with concentration of BHB and MUN greater than 0,2mmol/L and 300mg/kg, respectively. There was a considerable effect of non-nutritional factors, although variable according to factor and parameter. Models show that milk production, stage and number of lactation, and relation fat/protein influenced BHB and MUN concentration. BHB concentration is also influenced by somatic cells and milk fat, MUN concentration by milk protein